移动蛋白调控ToMV在寄主中病毒积累量的分子机理

【摘要】番茄花叶病毒（Tomatomosaicvirus,ToMV）是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员，寄主范围十分广泛，严重影响农作物的产量和质量。为了研究ToMV在寄主植物中的致病机理，本论文构建系统性表达绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein,GFP）的载体ToMV-GFP，研究移动蛋白（Movementprotein,MP）调控ToMV在烟草中基因组高含量积累的分子机制。主要结果如下：一、以ToMV为载体表达绿色荧光蛋白以pCB301-ToMV-N5的农杆菌侵染性克隆为骨架，通过PCR、酶切/连接等技术将病毒外壳蛋白（Coatprotein,CP）缺失，并以GFP代替，获得重组克隆pCB301-ToMV-N5CP45GFP。农杆菌浸润接种本氏烟的结果表明，该载体高效表达GFP，农杆菌接种浓度（OD600）为0.002时，GFP也能够有效表达。由于病毒缺失CP导致病毒不能移动至寄主非接种部位，我们将TMGMV-U5的包含CP的大小为647n（t5498-6145nt）片段克隆到pCB301-ToMV-N5CP45GFP中，得到pCB301-ToMV-N5CP45GFP-CPU5，浸润接种的结果表明，其能系统性移动，在烟草的非接种叶中GFP大量表达。二、ToMV的移动蛋白提高病毒在寄主上的积累本实验室成功构建pCB301-ToMV-N5、pCB301-ToMV-S1和MP互换的嵌合重组病毒pCB301-ToMV-N5MPS1、pCB301-ToMV-S1MPN5的农杆菌侵染性克隆，番茄和本氏烟浸润接种结果显示ToMV-N5株系的MP可提高病毒在寄主中的含量。系统性侵染本氏烟的ToMV-GFP的结果表明，在接种叶和系统叶中，ToMV-N5CP45GFP-CPU5的含量高于ToMV-N5MPS1CP45GFP-CPU5（MP由ToMV-S1的MP替代），在病毒接种的12天，二者在寄主的病毒含量上没有明显的差异；同样ToMV-S1CP45GFP-CPU5的GFP含量低于ToMV-S1MPN5CP45GFP-CPU5（MP由ToMV-N5的MP替代），病毒接种12天时病毒含量无明显差异。ToMV瞬时表达GFP的结果也表明ToMV-N5的MP能提高ToMV-S1在寄主中的病毒积累量。为了进一步研究ToMV-N5的MP提高病毒含量的作用机制，通过构建p35S-N5MP和p35S-S1MP瞬时表达载体。将p35S-MP与ToMV-N5CP45GFP、ToMV-N5MPS1CP45GFP以及ToMV-N5MPSFCP45GFP（MP发生移码突变）组合后接种本氏烟，结果显示ToMV的MP蛋白确实影响病毒在寄主中的含量积累且ToMV-N5的MP作用较ToMV-S1的显著。沉默抑制子活性测定的实验表明，ToMV-N5的MP提高病毒的含量不是以基因沉默抑制子调控寄主来实现的。将ToMV-N5CP45GFP、ToMV-N5MPS1CP45GFP菌液浓度稀释5000倍后接种本氏烟发现2个株系的MP对病毒细胞间移动效率无明显影响，因此ToMV-N5提高病毒含量与病毒的细胞-细胞间移动无关。三、MP定位在寄主内质网上并形成大的包涵体将ToMV-N5CP45GFP、ToMV-N5MPS1CP45GFP和p35S-N5MP、p35S-S1MP组合后混和接种本氏烟，病毒接种后2和3天，显微镜下观察病毒的侵染点结果表明N5MP和S1MP均能提高ToMV-N5MPS1CP45GFP在烟草叶片中产生侵染点的数量，并且前者比后者的效果更明显，因此ToMV-N5株系的MP提高病毒含量是由于其参与了ToMV的复制过程。为了研究MP在寄主的亚细胞定位，本实验构建了ToMVMP:GFP和35S-MP:GFP的MP和GFP融合蛋白表达载体。共聚焦显微镜结果表明，2个株系的MP均定位于内质网，且N5MP在内质网及细胞骨架处形成大的包涵体，而S1的MP形成的包涵体则较少且小。
【作者】刘妮娜；
【导师】廖乾生；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】番茄花叶病毒；移动蛋白；高病毒基因组含量；绿色荧光蛋白；瞬时表达；定位；

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